experiment(실험)보고서 - Plasmid DNA Purification
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작성일 23-02-11 18:56
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EDTA는 이 2가 양이온들을 킬레이트화하여 세포벽의 견고함이 약해지게 해 세포가 잘 lysis 되도록 한다.
다. 이러한 분리 방법 중 널리 사용되는 방법 중 하나가 Alkaline Lysis법이다. 이러한 분리 방법 중 널리 사용되는 방법 중 하나가 Alkaline Lysis법이다. 하지만 plasmid는 작은 크기의 원형 DNA로 정확하게 renaturation되어 용액에 녹아져 있지만, 염색체는 renaturation 과정에서 변성되었던 두 가닥의 random association 때문에 SDS에 의해 변성된 단백질과 함께 침전된다된다.
설명
- EDTA : 2가 양이온들은 세포내 많은 효소작용의 보조인자로 사용되고 특히 Ca2+는 세포벽을 유지하는데 중요한 역할을 한다.
Plasmid는 bacteria 세포의 염색체와는 별도로 존재하면서 self-replication을 할 수 있는 원형 DNA 분자로 적은 수의 gene을 가지고 있다.
- NaOH : 용액을 높은 pH의 alkaline 상태를 만들어 주어, 염색체와 plasmid DNA를 모두 변성시킴.
2) Lysis buffer
실험보고서, Plasmid DNA Purification
1) Resuspension buffer
- Tris (pH=8.0) : Solution의 완충제 역할을 한다.
- Glucose : 세포와 solution 사이의 삼투압을 유지시킨다. [실험 2]에 관한 내용은 서론에 충분히 설명(說明)하였으므로 이번 논의에서는 실험 과정에 대하여 살펴보자.3)
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- RNase A : Bacteria의 RNA를 제거한다.
- inverting 이후의 색change(변화) : 용액이 염기성이기 때문에 pH에 따른 자주색 indicator가 나타난다.
Plasmid DNA purification 과정 후 agarose gel eletrophoresis를 통해 purification이 잘 되었음을 확인할 수 있었다.experiment(실험)보고서 - Plasmid DNA Purification
순서
3) Neutralization buffer
- SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) : Detergent로써 세포막 ingredient을 녹이고 세포 단백질을 변성시켜 제거할 수 있도록 해주어 plasmid를 분리할 수 있게 해준다.1) Plasmid는 주로 대장균 세포에서 증식되며 vector DNA로 사용되기 위하여 대량 증식된 대장균 세포로부터 분리하여 사용하게 되는데 대장균 세포내에서 염색체와는 별도로 존재하기 때문에, plasmid DNA 분리는 염색체 DNA가 포함되지 않게 분리하는 방법이 사용되게 된다.
- Potassium acetate : pH를 중성으로 낮춰주어, DNA가 모두 renaturation 되게 한다.1) Plasmid는 주로 대장균 세포에서 증식되며 vector DNA로 사용되기 위하여 대량 증식된 대장균 세포로부터 분리하여 사용하게 되는데 대장균 세포내에서 염색체와는 별도로 존재하기 때문에, plasmid DNA 분리는 염색체 DNA가 포함되지 않게 분리하는 방법이 사용되게 된다. 이 plasmid는 유전자 재조합 시 재조합 DNA 조작을 위한 vector DNA(숙주에 이종의 DNA를 운반하는 DNA)로 사용되며 원하는 DNA 단편을 넣어 gene cloning 등에 널리 이용된다. 그리고 세포 lysis로 인하여 방출된 DNA 분해 효소들이 불활성화되어 plasmid 분리 효율을 높여준다.
레포트 > 공학,기술계열
- vortexing 하지 않고 inverting 하는 이유 : mixing과정에서 대장균 염색체 DNA가 물리적으로 절단되는 것을 방지하기 위해 물리적 충격을 최소화해야 한다. SDS은 Neutralization buffer의 주ingredient인 Potassium aetate와 반응하여 비용해성인 Potassium dodecyl sulfate를 형성하여 하얀색의 침전물이 생기게 한다.
Plasmid는 bacteria 세포의 염색체와는 별도로 존재하면서 self-replication을 할 수 있는 원형 DNA 분자로 적은 수의 gene을 가지고 있다 이 plasmid는 유전자 재조합 시 재조합 DNA 조작을 위한 vector DNA(숙주에 이종의 DNA를 운반하는 DNA)로 사용되며 원하는 DNA 단편을 넣어 gene cloning 등에 널리 이용된다.
